活髓治療的生物學基礎
發布時間：2011-10-18 共1頁
如何在牙髓受到損傷時保存活髓一直是國內外學者所共同關心的熱點問題之一。牙髓在受到創傷感染時，其儲備的未分化細胞可分化為造牙本質細胞，分泌牙本質基質，將牙髓與創傷感染面分離，從而使牙髓具備了創傷修復的潛能。這種潛能是牙髓細胞固有的生理機能，也是牙髓活髓保存治療的生物學基礎。另外，應用合適的蓋髓材料，將牙髓與感染組織隔離，為牙髓組織的自身修復提供良好的生物學環境，對于活髓保存治療也是至關重要。近年來，上述研究進展迅速，本文特就此作一綜述。
一、牙髓自身修復的特點
牙髓作為機體的一種特殊組織，其修復方式亦具有其獨特性――以牙本質橋形成為特征。其修復的基礎是牙髓細胞具有再生分化的潛能。當牙髓細胞受到齲損，理化，或機械等各種因素刺激時，可能造成造牙本質細胞的損傷甚至死亡。如果刺激比較輕微，與刺激接觸的造牙本質細胞可以迅速的分泌新的牙本質基質形成反應性牙本質[1]；而較強的刺激則可能造成造牙本質細胞的死亡。若此時牙髓和牙本質交界處的條件適當，在一系列胞外基質和生長因子的協同作用下，牙髓細胞分化形成新一代的造牙本質細胞，分泌修復性牙本質[2].由此可見，進一步了解造牙本質細胞的形成分化機理將對活髓保存治療起著至關重要的作用。
二、牙髓損傷修復的細胞學基礎
2.1造牙本質細胞的表型
造牙本質細胞是終末分化細胞，最后一次有絲分裂后期細胞發生極化，細胞骨架重排，分泌前期牙本質[3]，同時牙本質特異蛋白，包括，牙本質磷蛋白，牙本質唾蛋白，及牙本質基質蛋白[4].
修復牙本質形成過程中形成的新一代造牙本質樣細胞與原發的成牙本質細胞是否具有相同的表型還不清楚。通過纖維連接蛋白植入牙髓后的觀察，認為與原發的造牙本質細胞一致[5].然而，chiego等通過對原發的和新的造牙本質樣細胞的超微結構和放射自顯影比較研究后證明兩者的生物合成活性不同[6]，所以將新形成的細胞稱之為造牙本質樣細胞。目前造牙本質樣細胞的評價標準還沒有確定，但由于其能分泌極化的前期牙本質，所以雖然細胞并沒有出現極化，但通常被認為是新的造牙本質細胞
2.2骨樣牙本質和管樣牙本質的形成
牙齒發育的過程中在釉上皮和基底膜的誘導下，外圍的牙乳頭細胞分化成為造牙本質細胞，分泌管樣牙本質。但在牙髓損傷修復的過程中，缺乏牙釉質和基底膜，牙本質同樣也能發生。新的造牙本質細胞如何分化成熟，受何種因素的誘導調控？大量證據表明，胞外基質成分發揮了類似基底膜的作用，其中Fn和TCF-β，BMP超家族作用尤為突出。Nakashima等粗純的骨BMP植入狗牙髓腔觀察牙髓對BMP的反應，結果發現管狀基質需要由非極化細胞分泌管狀基質來啟動，管狀牙本質則由完全分化的造牙本質細胞分泌[7].由此可見，牙髓細胞分化成為造牙本質樣細胞并分泌骨樣及管樣牙本質，關鍵是取決于細胞與基質的相互作用，這種作用可能影響造牙本質樣細胞表型的表達，調節牙髓細胞的遷移，增生及分化過程。
三、牙髓損傷修復的分子學基礎
在成牙本質細胞的分化過程中胞外基質參與了重要作用，同時還參與了牙髓的損傷修復過程。胞外基質主要由膠原、蛋白多糖、糖蛋白、牙本質非膠原蛋白（non-collagenous protein，NCPs）及各種細胞因子等組成。其中纖維連接蛋白（fibronectins，Fn）及細胞因子作用明顯。
3.1纖維連接蛋白（fibronetion，Fn）
纖維連接蛋白屬于高分子量的糖蛋白，由兩條或者是更多的肽鏈及一些低聚糖分子組成。每條肽鏈上有多個低聚糖分子側鏈，這種結構很適合于作為細胞和細胞外基質之間的配體，因而主要功能是介導細胞與細胞，細胞與基質間的粘附，在牙齒發生和牙髓損傷愈合時起重要作用。Tziafas等用具有同源性的血漿Fn置于狗牙髓腔，觀察其對牙本質的誘導能力。結果表明1周后就能誘導造牙本質細胞的分化，4周后形成一厚層非管狀牙本質基質，未見管狀牙本質形成[5].以后又用脫鈣牙本質置于狗牙髓腔研究Fn的免疫定位，結果發現脫鈣牙本質三天就有明顯的Fn吸附，由極化或非極化的的細胞分泌的未鈣化基質含有豐富的Fn，提示脫鈣牙本質的誘導作用可能是由牙髓暴露于含Fn的表面所啟動的[8].
3.2細胞因子
細胞因子（cytokine）是由各種細胞分泌的，并能調節細胞功能的小分子多肽。迄今已發現許多種細胞因子參與了牙髓組織的自身修復：包括轉化生長因子β超家族（transforming growth factor-βs，TGF-βs），胰島素樣因子-I（insulin-like growth factor-I，IGF-I），成纖維細胞生長因子（fribroblast growth factor，FGF），血小板衍生生長因子（patelet derived growth factor，PDGF）等，其中轉化生長因子超家族β研究較多，也較深入。
轉化生長因子β超家族包括轉化生長因子β（transforming growth factor-βs，TGF-β）、activins、和骨形成蛋白（bone mophogenetic proteins，BMPs），與修復性牙本質形成關系較為密切的有BMP-2，BMP-4.
生長轉化因子β（TGF-β）分子量為25000u，由兩條相同的單鏈組成，十余年前，其（TGF-β）從人血小板、人胎盤中分離出來，2年以后這種分子被克隆化，并相繼在脊椎動物中發現5種異構體。人體中有3種異構體，即TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3.它們之間存在 70~80??同緣性，并有許多相似的生物學作用[38].
Tziafas等發現，預先用TCF-β中和抗體浸泡的脫鈣牙本質完全失去了誘導造牙本質細胞分化的能力；正常的牙本質用TCF-β中和抗體處理后，僅能刺激形成纖維性牙本質；用來自人血小板的TCF-β浸泡的微孔濾膜種植于牙髓，可見極化的牙髓細胞被一層厚厚的管狀牙本質包繞。該實驗表明TGF-β與成牙本質細胞分化及牙本質基質分泌的調節密切相關[9]
Cassidy等證實人牙本質中含有TGF-β，牙本質中的TGF-β很有可能參加了牙髓損傷的修復[10].他們從兔牙本質中成功的提取出了TGF-β，并發現大約有一半以活性形式存在，另一半以非活性形式存在，與不容性的膠原纖維基質結合在一起，但這種非活性的TGF-β很容易被溶解和活化，當牙髓損傷后，如齲病，細菌所產生的酸可以溶解牙本質中的TGF-β并使之活化，參與牙髓損傷的修復[11]
TGF-β超家族功能的發揮是受細胞表面的特異受體控制。已經發現6種不同的I型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，稱為active recepter-like Kinases（ALK-1~6）， TGF-βs和BMPs的II型受體也已分離出來。Toyono等通過牛的原代牙髓細胞培養觀察TGF-β超家族成員和他們的受體在造牙本質細胞分化中的表達情況，說明牛牙髓細胞分化為造牙本質細胞可能與TGF-β超家族成員和它們的受體的臨時協同表達有關，包括TGF-β1，BMP-4，ALK-2，ALK-3和ALK-5的上轉錄上調[12].
Martin等觀察了aFGF，bFGF，TGF-β1和IGF-1對造牙本質細胞分化的影響。結果表明在體外培養條件下，aFGF或bFGF單獨作用時，都不能誘導造牙本質細胞分化，而aFGF，bFGF與IGF-1或TGF-β1共同作用時可發揮作用，促進牙乳頭細胞的極化和功能性分化[13]，說明生長因子之間可能存在著復雜的協同作用。
3.3牙髓細胞中堿性磷酸酶
堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是體內廣泛分布，對生長發育有重要意義的水解酶。其分子結構為二聚體分子，兩亞基間具有協同效應。其作用底物較為廣泛，大多數酶活性定位于微粒體酶活性相關細胞器中，如漿膜，粗面內質網，滑面內質網和Golgi‘s器來源的小囊中。組織化學的方法證實[14]，前期牙本質和造牙本質細胞層內的酶活力相當高，發育期牙的形成細胞中含有ALP，均分布于短柱狀的分泌后期造釉細胞，中間層，星網層和外釉上皮層細胞。不同發育時期，酶活力亦有異常。ALP可作為牙髓組織活力的一種指標。目前，較為肯定的是它與牙本質沉淀和礦化密切相關。文玲英等[15]用組織化學和圖象分析的手段觀察了人乳牙和年輕恒牙牙髓組織中的ALP的分布特征，發現二者間有顯著差異，并由此認為乳牙牙髓的自身修復潛能遠不及年輕恒牙。Attalla[16]曾將純化的ALP直接用于穿髓點，可導致牙髓細胞分化為造牙本質細胞和牙本質基質的形成。其確切的機理，尚待進一步討論。
3.4牙髓組織中的神經及神經肽
牙髓神經中含有豐富的軀體感覺和自律神經。前者的低級中樞位于三叉神經節，一般可分為A纖維和C纖維。它們共同擔負著牙髓的感覺功能[17].近年來的研究發現，C纖維對傷害性刺激傳入中樞有特殊的意義，與牙髓炎癥、痛覺過敏機制以及生長發育過程密切相關[17~19].
神經肽（neuropeptides）是機體內傳遞信息的小分子多肽，主要分布于神經組織，在其它組織，亦有廣泛分布。在信息傳遞過程中可起遞質（transmitter）或調質（modulator）作用。目前發現牙髓感覺神經中的主要物質有三類：P物質（substance P，SP），降鈣素基因相關肽（calcitontin gene_related peptide，CGRP）和神經激肽A（nerokinin，NKA）[17].含SP的神經纖維與血管一起成束地通過根尖孔進入牙髓，在牙髓中呈網狀分布。多與神經伴行。但并不是所有的神經都與血管伴行，也不是所有的血管都伴有神經[18].在造牙本質細胞層，含SP的單條神經纖維可發出分支穿過造牙本質細胞層，并進入前期牙本質[19].CGRP和NKA免疫陽性神經纖維在牙髓組織中的分布與SP相似。在自律神經中的神經肽主要有神經肽Y（neuropeptide Y）和血管活性腸多肽（vasoactive intestinal polytide，VIP）[17，20]生理學和藥理學實驗發現SP和CGRP都具有舒張血管的作用，而NPY具有收縮血管的作用，它門可能參與血管循環的調節。尚有實驗發現SP和SGRP能促進血管內皮細胞的增殖，并且二者有協同作用[20].當牙髓受到機械刺激時，牙髓SP、CGRP免疫陽性纖維數量發生變化，提示SP，CGRP等神經肽在損傷所致牙本質修復過程中有重要意義[21，22].最近，Nagata[23]觀察到鼠發育中牙齒的增生上皮內存在SP和CGRP免疫陽性神經纖維，認為它與牙齒發育早期上皮細胞的短暫增生有關。推測SP和CGRP可能作為細胞因子，控制細胞增生的時間和分布。另有人[24]觀察了人牙胚中神經內分泌蛋白基因產物9.5（protain gene product 9.5）的分布特征。發現在牙胚發育早期，牙囊及牙乳頭中既有PRG9.5陽性神經纖維的出現，推測其對牙囊及牙乳頭的發育有誘導作用。認為它與牙本質形成有關。同時發現，PRG9.5在成熟造牙本質細胞中呈陽性反應。由此提示了神經及神經肽在牙髓細胞的誘導分化過程中有重大意義。但其確切作用及機理尚待進一步闡明
3.5牙髓中的自由基
自由基（free redical）是含有未配對電子的原子或原子團，其化學性質非常活躍，在多種生理、病理機制中有重要意義。當前，對于自由基研究比較活躍的領域是對活性氧（active oxygen specles，AOS）的研究[25~27].
AOS包括超氧陰離子自由基，羥自由基、過氧化氫、單線態氧、和脂質過氧化物（looh）生理狀態下，機體可以通過酶促及非酶促反應產生少量AOS，但很快被機體內的消除系統，如維生素E，C及酶類。包括超氧化物歧化酶（superoride dismutase.SOD）、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶所清除[25].使健康機體內自由基的產生與消除處于一種平衡狀態。一旦這種平衡被打破，機體就會受到損傷。這對炎癥、損傷的發病機制有重要意義。
對超氧因子自由基來講，特異的清除劑是SOD.石冢克已[26]對實驗性牙髓炎中花生四烯酸極其代謝產物的動態變化進行了研究，發現牙髓炎癥的的發病及預后與這對平衡體系有關。后來，國內吳補領[27]等研究了人牙髓炎癥時超氧陰離子自由基及SOD的變化，取得了相似的結果。并發現正常牙髓組織SOD酶活力具有增齡改變，推測SOD可能與牙髓自身修復能力下降有關
近年來，人們對自由基的研究熱點逐漸轉移到一氧化氮自由基（nitric oxide，NO）上來。NO是在機體內尿素循環?D?D左精氨酸在一氧化氮合成酶（nosynthase，NOS）作用下生成瓜氨酸的過程中釋放出來的。最初發現是血管內皮細胞合成釋放NO，并作為血管內皮細胞松弛因子。后來發現多種組織，細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、肝細胞、血小板及某些腫瘤細胞均可合成NO.目前認為神經系統是最重要的NO合成場所[28].其生理功能包括細胞信使及細胞毒兩個方面。它涉及到中樞神經系統的信息傳遞、心血管調節、免疫調節及內分泌調節等過程，現已證實。NO是一種新的神經調質，尤其是與傷害刺激傳入功能有關[29].同時，由NO引來非特異性免疫的現象，當Mφ被內毒素或T細胞激活。可誘導表達NOS，而合成釋放NO，作為宿主的防御機制，殺滅侵入機體的抗原物質。因而，NO同時具備細胞穩定（cytotostatic）和細胞毒（cytotoxic）二重作用。曾有學者提出[30]：乙酰膽堿、SP緩激肽等的效應需NO介導，并且有實驗證實NOS與VIP，SP可共存于同一種神經原內[31].由此提示，牙髓組織的NO對于牙髓組織損傷、炎癥及修復過程可能有重要意義。但有待進一步研究探討。
四、蓋髓材料
隨著對活髓治療生物學基礎理論的深入和完善一系列新的蓋髓材料及技術應運而生，其中以生長因子復合蓋髓材料及激光輔助蓋髓技術最具代表性
4.1生長因子復合蓋髓材料
膠原是人牙髓和牙本質的有機組分，可以刺激上皮分化，維持細胞附著及生長。Rucherford[32]等以膠原復合bmp蓋髓后，蓋髓材料被未分化的牙髓細胞侵入，機化為富含血管、纖維的牙髓樣結締組織，隨后礦化形成骨樣牙本質。Bmp2和bmp4復合膠原蛋白I作蓋髓劑，可使牙髓細胞增生，分泌基質形成骨樣牙本質（內含骨樣牙本質細胞），該反應成BMP劑量依賴性。而膠遠蛋白I復合2μg TGF-β1時，牙髓組織表現為增生抑制，膠原未被吸收。上述均為誘導出造牙本質細胞分化并形成管樣牙本質，這可能和應用了重組BMP及TGF-β1有關。重組蛋白成分單一，另據報道[33]，較之TGF-β1，TGF-β2對成牙本質細胞更具分化誘導活性。
牙本質基質具有誘導活性，其活性與TGF-β樣物質相關[34].經脫脂、鹽酸胍浸潤出等處理后活性喪失，膠原纖維暴露。有學者[35]以其復合硫酸軟骨素和膠原粉作BMP載體蓋髓，發現形成兩層牙本質，上層是未分化的牙髓細胞和梭型細胞產生的骨樣牙本質，牙髓反應先是成纖維細胞樣細胞增殖，載體材料提供了適宜細胞附著及分化的條件，細胞附著，然后BMP刺激其分化。載體材料發揮重要作用。
李國華、趙京寧[36]等應用β轉化因子復合骨形成蛋白（TGF-β/BMP）覆蓋狗暴露牙髓，術后8周發現，TGF-β/BMP能誘導牙成纖維細胞、內皮細胞增殖并抑制炎癥反應，提高牙髓修復能力，且有完整的的牙本質橋形成。
總之，BMP在活髓保存應用取得了一定進展，TGF-β在活髓保存的應用還有待于進一步研究；多種生長因子復合應用以發揮其協同作用將是未來發展方向，同時，臨床應用這一類生長因子，尚需解決其載體材料的研制、應用問題。
4.2鈣磷陶瓷類蓋髓材料
鈣磷陶瓷主要為可降解的磷酸鈣和幾乎不溶的β羥磷灰石（Hydroxylapatite， HA）等。其組成和牙本質礦物質構成相似，生物相容性好，對蛋白質、細胞等有一定親和性。一般認為這種材料本身只具有引導活性，而無分化作用。Jaber L[37]等將其應用于鼠牙蓋髓，并作了病理學及計算機影象學分析。他們發現雖然HA具有骨誘導潛能，但與Dycal 相比，其蓋髓時誘發的牙髓炎癥反應時間較長，誘導形成完整牙本質橋的幾率較低。并且由于顆粒分散，易誘發髓腔的廣泛鈣化，所以，Jager L等認為HA應用于臨床蓋髓還有待進一步完善。
五、激光之于活髓保存
陳新梅、肖明振等[38]對107個狗牙露髓面用3個不同參數的ND-YAG激光照射后，用氫氧化鈣蓋髓，與單純用氫氧化鈣比較發現：低能量的激光有利于照射區和側方修復性牙本質形成，促進下方創傷愈合的作用，而高能量的激光照射可能引起牙髓的壞死。他們認為激光的熱刺激作用使牙髓細胞受損，而牙髓細胞在恢復過程中被活化，從而促進修復性牙本質形成，另外，激光的照射也具有殺菌、止血和減短手術時間、降低露髓面損傷和感染的機會，從而大大提高了活髓保存治療的成功率。
六、展望
綜上所述，隨著對牙髓損傷機制認識的深入，以及材料學的飛速發展，更多更好的蓋髓材料及蓋髓方法將會產生，活髓保存治療范圍將會擴大，其成功率將會大大提高，將有更多的患者從活髓保存治療中受益。
